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2001年，参与拍摄个人第一部电视剧作品《折扇探花》，在剧中饰演沈西铭一角，并凭借该剧正式进入演艺圈。

2002年，参与拍摄张庭、任达华等主演的足球题材青春励志剧《壮志雄心》，在剧中饰演刘辉一角。

2003年，参演由蒋家骏执导，林心如、陆毅等人主演的代都市情感时装励志剧《男才女貌》，饰演赵磊。

2004年，与孙兴、崔智友合作主演由霍耀良、张敏执导的爱情题材电视剧《第101次求婚》，在剧中饰演孙兴的弟弟郑金元；同年，参演由蒋家骏执导，黄晓明、于娜等主演的时装剧《女才男貌》，该剧于2015年4月在央视八套播出。

2005年，参演蒋家骏、钟少雄执导，林峯、陈怡蓉主演的时装爱情剧《爱情新呼吸》，在剧中饰演理查一角。

2006年，参与拍摄童蕾、郭晓冬主演的爱情悬疑电视剧《谁懂我的心》，饰演邵永康的哥哥罗一阳，该剧于2008年4月首播。

2007年，再次参演蒋家骏执导的都市情感电视剧《伤城之恋》，该剧由霍建华、秦岚等主演，于2008年在中国香港播出。

2008年，与刘之冰、孙宁等人共同主演都市励志题材电视剧《永不言退》，在剧中饰演赵博风；同年，在连谏执导的悬疑剧《生死诺言》中饰演陆天扬一角；随后参演姚芊羽、保剑锋等人主演的都市温情励志剧《我是一棵小草》，在剧中饰演岳小梅的哥哥岳峰。

2009年，参演由何洛、罗刚联合执导，霍建华、张萌、黄觉等主演的民国破案题材电视剧《唐琅探案》

2010年，参演由林龙,何洛等人执导的都市情感励志剧《金枝玉叶》，在剧中饰演警察杜川，该剧于2011年8月在央视八套播出；同年，参演由张国立执导，唐国强、张国立、蒋勤勤等主演，以重庆谈判为背景拍摄的历史战争题材电视剧《中国1945之重庆风云》，饰演王龙一角。

2011年，与吴秀波、张嘉译等人共同主演医疗行业剧《心术》，在剧中饰演因医闹被医院开除后转做处理医患关系的律师谷超华，并为该剧演唱主题曲《感动》；同年，参与拍摄胡静、陈楚河主演的民国宅斗戏《笑红颜》，饰演苏明利，并演唱了该剧的片尾曲《寻花》；后与黄海冰、张萌等人共同主演建党90周年献礼剧《开天辟地》，在剧中饰演反派汪精卫一角；同年主演由李惠民执导的谍战剧《生死钟声》，在剧中饰演风度翩翩、心机缜密、崇美思想严重的反面角色瞿言白。

2012年，出演个人首部电影作品《诡爱》，该剧根据于传松的同名恐怖小说《诡爱》改编而成，由梁婷执导，于2012年万圣节档期在中国上映；同年，参演由卢伦常和李文龙执导的都市情感励志轻喜剧《爱情面前谁怕谁》，饰演善良、正直的黎海波主管。

2013年，主演张多福执导的“幸福三部曲”系列电视剧中的第二部《幸福在哪里》，饰演腹黑反派韩江川；同年，在林添一执导，胡静、翁虹等主演的爱情题材年代剧《泪洒女人花》中饰演高立伯一角；同年，出演古装偶像剧《王的女人》，在剧中饰演陈国大王胡亥一角，该剧是于毅自出以来接拍的第二部古装剧；同年10月，凭借战争题材电视剧《打狗棍》中二丫头一角，获得了“2013年国剧盛典观众最喜爱角色”的荣誉奖项。

2014年，与杨志刚共同主演由郭靖宇、柏杉执导的年代传奇剧《勇敢的心》，饰演赵舒城，并演唱了该剧的主题曲和片尾曲两首曲目；同年，首次接触网络剧，主演中国悬疑灵异题材网络剧《灵魂摆渡》；随后，主演由张多福执导的抗战题材电视剧《绝地枪王》在四家卫视同步播出。

2015年，继续主演《灵魂摆渡》系列网剧的第二部《灵魂摆渡2》，并演唱同名主题曲《灵魂摆渡》，以及为该剧创作片尾曲《君生吾未生》。同年，主演由常晓阳执导的都市情感剧《转身遇到你》。

2016年，主演母爱主题剧《娘道》，于毅在剧中一人分饰两角，扮演一对出生大户人家，但性格命运迥异的孪生兄弟；同年11月，主演的《灵魂摆渡》系列季播剧的最终季《灵魂摆渡3》在爱奇艺播出。

         2017年5月，主演网络电影《灵魂摆渡黄泉》。6月，出演李小平执导的刑侦剧《走火》，饰演严厉古怪的“师傅”赵鹏程。8月，

主演电视剧《黑土热血》在央视播出。

于毅凭借其扎实的表演功底以及对角色的理解和诠释方式，将爱憎分明、杀敌报国的热血英雄人物“二丫头”很好地展现在了观众面前，令观众称赞。（新华网评）

从《打狗棍》到《勇敢的心》再到后来的《绝地枪王》，很多的枪战戏、爆破戏，让于毅完成了勇敢的蜕变。于毅不光戏演的不错还是个很会唱的艺人，曾为主演的多部电视剧献声演唱主题曲和片尾曲，唱功不逊色于专业歌手。他不断突破自己，不但出演电视剧，参演音乐剧，话剧舞台他也常亮相演出。（新浪娱乐评）

在唱歌方面，于毅演唱的《灵魂摆渡》同名主题曲用摇滚的态度淋漓尽致地宣泄情绪。从《君生吾未生》中的中国风戏曲说唱演绎，到《灵魂摆渡》中的摇滚，能在各种曲风之间游转自如，展现了其音乐剧功底。（网易娱乐评）